Soepeno lahir di Tegal pada 12 Juni 1916. Ayahnya, Soemarno, bekerja sebagai S.S (staatsspoorwegen) ambtenaar (pegawai) di Stasiun Kereta Api Tegal. Latar belakang keluarganya adalah priyayi rendah, cukup mampu untuk membayar uang sekolah Soepeno. Beliau belajar di HIS selama tujuh tahun. Kemudian melanjutkan ke AMS-B di Semarang selama tiga tahun. Soepeno melanjutkan belajar di Technische Hooge School (THS) atau Sekolah Tinggi Teknik di Bandung (sekarang ITB). Kemudian beliau pindah ke Batavia untuk menjadi mahasiswa Rechts Hooge School (RHS), atau Sekolah Tinggi Hukum. Beliau hanya mencapai tingkat candidaat, tetapi karena rajin membaca dan belajar sendiri, pengetahuannya tentang hukum cukup luas. Dengan segala keterbatasannya, beliau dilibatkan dalam Badan Pekerja Komite Nasional Indonesia Pusat (BP KNIP).

Badan Pekerja KNIP yang berkantor di Jakarta terpaksa dipindahkan ke Purworejo karena situasi keamanan Jakarta yang tidak memungkinkan. Di Purworejo, Soepeno melaksanakan tugas sebagai sekretaris Badan Pekerja KNIP sejak 3 Maret 1946. Pada saat itu Mr. Assat menjabat sebagai Ketua Badan Pekerja KNIP. Atas permintaan Syahrir, pada 16 Oktober 1945 Soepeno berhasil menyusun anggota Badan Pekerja KNIP yang terdiri atas lima belas anggota.

Selain di Badan Pekerja KNIP, Soepeno menyumbang banyak pemikiran, seperti mereformasi fungsi KNIP dan mengeluarkan Maklumat X. Setelah Perjanjian Linggarjati pada November 1946, Soepeno kembali menyumbangkan gagasan untuk memperbanyak jumlah anggota KNIP yang bersidang di Malang pada Maret 1947.

Soepeno juga aktif dalam bidang kepemudaan. Beliau mendirikan Balai Pemuda di Surakarta dan Bukittingi. Saat beliau kembali dari Sumatera, terjadi penggantian kabinet. Kabinet Amir Syarifuddin jatuh akibat Perjanjian Renville yang merugikan Republik Indonesia. Pada awal 1948, dalam kabinet baru yang dipimpin Wakil Presiden Mohammad Hatta, Soepeno diangkat menjadi Menteri Pemuda dan Pembangunan. Beliau adalah menteri termuda dalam Kabinet Hatta.

Pada waktu melancarkan Agresi Militer II, yang dimulai 19 Desember 1948, Belanda berhasil menduduki Yogyakarta. Beberapa pimpinan negara, termasuk presiden dan wakil presiden ditangkap dan diasingkan ke luar Jawa. Soepeno berhasil meloloskan diri ke luar kota bersama Menteri Susanto Tirtoproyo, kemudian ikut bergerilya melawan Belanda.

Pada 24 Februari 1949, ketika rombongan Soepeno berada di Desa Ganter, Kabupaten Nganjuk, Jawa Timur, Belanda ternyata sedang menyerang desa tersebut. Akhirnya mereka tertangkap saat mandi di pancuran di pinggiran desa. Sebagai pejuang sejati, Soepeno bersikap tidak gentar ketika tertangkap. Beliau sempat dibawa ke pusat desa dan diinterogasi oleh tentara Belanda yang kemudian menembak mati Soepeno dan enam orang anggota rombongan lainnya.

Pada 24 Februari 1950 jenazahnya dipindahkan ke Taman Makam Pahlawan Kusumanegara, Yogyakarta. Masyarakat mengenangnya sebagai menteri gerilya. Pada 13 Juli 1970, berdasarkan Keppres No.039/TK/1970, pemerintah menobatkan Soepeno sebagai pahlawan nasional.